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單細胞測序

一.服務內容


我公司提供的單細胞建庫測序技術服務是針對大規模細胞群體進行表達譜分析,具體服務內容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術對細胞懸液樣本中的500~10,000個單細胞進行捕獲標記,同時對每個標記了的細胞中的RNA分子進行獨立標記,建成用于illumina測序平臺的轉錄組測序文庫。建成的文庫將在illumina NGS測序平臺上進行測序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對測序的結果進行解碼,并針對單個細胞的表達譜差異對樣本細胞群進行細胞亞群分析。

 

二.實驗操作步驟概述


1. 對單細胞懸浮液樣本進行10x Genomics上機,制備油包水微滴乳濁液(GEMS)。

2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀,進行逆轉錄操作。

3. 破乳后進行cDNA的回收、純化和擴增等操作。

4. 進行片段化,末端修復,加A、加接頭,Sample Index PCR等后續文庫構建操作。

 

三.實驗結果


我公司完成10x Genomics建庫技術服務的過程中提供2個結果,分別是文庫質檢結果報告和測序結果分析報告。

 

四.樣品要求及注意事項


1. 接收的樣品為單細胞懸液,如需組織解離,細胞分選等樣品制備需由客戶自行完成。

2. 單細胞懸液中,細胞間無粘連,無大于40uM的細胞碎片或其他顆粒物),單細胞懸液上樣前需過40uM細胞濾網(如Falcon cell strainer, REF 352340),確保不會堵塞微流控通道。

3. 細胞懸液中單細胞個數應大于預期實測細胞個數的2倍,如預期測到500個單細胞的數據,應提供至少1000個單細胞。

4. 細胞成活率應大于85%(用臺盼藍染色檢測)。

5. 上機單細胞懸液體積應小于30ul,建議細胞懸液濃度大約為1000個細胞/ul。

6. 如一次性上機多個樣品,第一個樣品制備完成到最后一個樣品制備完成時間相差不超過1個小時。

 

五.服務驗收標準


在細胞樣品達到上述要求的前提下,結果達到如下標準:

1.測序文庫合格:文庫檢測為單峰,且濃度高于3nM,體積大于25ul。

2.細胞捕獲效率達到50%:最終測序數據結果中的細胞數達到50%的起始細胞數。

 

六.服務承諾


1. 對于達到樣本要求的實驗,由于細胞計數誤差等實驗中存在的不確定性,實驗結果在上述標準的±20%以內都為可以接受的范圍。如果結果在驗收標準20%以下的(即捕獲效率低于40%)可判定實驗失敗,公司將承擔該樣本的試劑耗材及服務費等全部費用。

2. 如果實驗過程中確認試劑耗材質量的問題,我公司負責向10x Genomics廠家申請賠付。(通過其它渠道采購的試劑耗材,我們也將協助客戶完成索賠)

3. 如果細胞樣品未達到要求,客戶可以選擇重新送樣或風險上機,風險上機將不能按照上述標準驗收。

 

七.常見問題解答


1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標準是65%,為什么貴公司承諾只有50%?

答:廠家測試捕獲效率用的是細胞系,細胞系樣品很容易制備成單細胞懸液,且能保證較高的細胞活性和完整性,而服務項目客戶很少用細胞系,大部分是用組織解離制備的細胞懸液,其細胞成活率相對較低,而且細胞計數的方法也會給結果造成一定偏差,因此我們把標準定在50%。

 

2. 建好的文庫送給測序公司上機前,文庫質檢達不到測序公司的合格標準怎么辦?

答:測序公司出于免責的考慮,對客戶自建的文庫質檢標準會比較嚴格,因此有可能我們庫檢沒問題的樣品測序公司會判定為不合格。請把測序公司的文庫質檢結果發送劉元和牛松,我們根據質檢結果判定是否應承擔測序上機風險。

 

3. 如果實驗失敗了,貴公司如何賠償?

答:兩種情況,一是如果因10x芯片或試劑導致實驗失敗,我們負責聯系廠家索賠,服務項目就更換試劑耗材重新做實驗。二是客戶細胞樣品合格、非風險上機情況下建庫失敗,就不收取費用。實驗過程中的問題,我們和客戶應本著互信原則協商解決,實驗失敗我們不對客戶細胞樣品進行賠償。


4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進行的標準分析外,貴公司還能提供哪些分析?

答:基本分析 

 ⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉化為fastq,生成后期的樣本index序列文件,UMI序列及MRNA序列。

 ⑵ 序列比對注釋 將序列比對到相應的參考基因組的基因區域。

 ⑶ 按照細胞和基因組信息統計UMI,barcode信息,計算細胞和基因表達矩陣。

    其他高級分析

 ⑴ t-SNE降維分析及聚類:利用T分布隨機相鄰嵌入法(t-SNE)對數據降維處理,基于2維數據展示。利用聚類算法對細胞進行聚類分析,聚類后的細胞群體之間進行差異表達分析。

 ⑵ 基因的富集分析:差異基因進行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。


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